Nature | 生物分子凝聚体的预湿润驱动上皮组织中紧密连接带的形成

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2024年8月7日，德国马普所Alf Honigmann研究团队在Nature发表题为“Membrane prewetting by condensates promotes tight-junction belt formation”的研究，该文章主要探讨了生物分子凝聚体在细胞膜界面形成紧密连接带（tight-junction belt）的过程，作者通过实验直接证明了紧密连接带的形成涉及与顶端膜（apical membrane）界面相互作用的 ZO-1 凝聚物的预润湿（prewetting）现象。

摘要

生物分子凝聚物通过相分离实现细胞区室化，然而这些凝聚物如何与细胞膜等其他结构相互作用，以驱动形态转变仍不清楚。本文发现，紧密连接带的形成对于密封上皮组织至关重要，它的形成由促进了ZO-1 凝聚层在顶端膜界面周围生长的这种润湿现象驱动。研究人员利用时间邻近蛋白质组学结合成像和热力学理论，发现极性蛋白 PATJ 介导 ZO-1 转变为凝聚的表面层，并在顶端界面周围伸长。与实验观察结果一致，作者的凝聚物生长理论表明，延伸速度取决于 ZO-1 与顶端界面的结合亲和力，并且是恒定的。另外，通过突变、截断回补 PATJ实验，作者表明 ZO-1 界面结合对于紧密连接带的形成必要且充分。本文研究结果阐明了细胞如何利用膜界面蛋白质凝聚物的通用生物物理特性来塑造细胞的中尺度结构。

背景

紧密连接（tight junction）是一种超分子粘附复合物，通过在细胞间形成扩散屏障来控制溶质的细胞旁流动ⁱ。紧密连接的组装起始于细胞质支架 ZO 蛋白在细胞-细胞接触点的凝聚，随着时间的推移，这些蛋白在顶端细胞周围延伸并融合，形成一条连续的带，从而密封组织。然而这些膜凝聚物的成分如何发生变化，如何形成连续的紧密连接带尚不清楚。理论上，生物分子凝聚物在细胞结构（如膜）上的物理润湿可以通过凝聚物界面上出现的力来驱动形态变化。当相分离成分与膜的结合强度足够时，可以在饱和浓度以下发生从稀疏吸附层到凝聚表面层的转变，这被称为预湿润（prewetting）转变ⁱⁱ。

首先为了了解紧密连接带是如何组装和定位的，作者结合了主要连接支架蛋白 ZO-1 的 APEX2 邻近蛋白质组学与钙开关组织形成实验。利用这种组合，可以通过向培养基中添加钙的方式来同步启动整个组织中连接组装，并使用邻近蛋白质组学量化组装过程中连接蛋白质组的时间演变。根据 ZO-1 分布的动态，作者将紧密连接带组装过程细分为四个形态阶段（图 1a）。在 0 小时到 0.5 小时之间，细胞质 ZO-1 在新生细胞 - 细胞接触处凝聚。在 1 小时到 3 小时之间，ZO-1 初始膜凝聚物延伸并融合成连续带。最后，在 3 小时至 18 小时之间，连接带和细胞形状平衡为稳定的汇合上皮单层（图 1a）。为了捕捉伴随形态转变的分子变化，在钙开关后 0 小时、0.5 小时、1 小时、3 小时和 18 小时进行了 ZO-1 蛋白质组学邻近标记和质谱分析。为了分析 ZO-1 相互作用组随紧密连接组装时间的变化，作者计算了蛋白质丰度相对于钙耗竭状态（0 小时）的倍数变化（图 1b）。结果显示，在组装过程中，ZO-1 附近的蛋白质数量显著增加，表明凝聚物成核后的组成会随着时间的推移发生强烈重塑。

已知紧密连接被划分为不同的功能区域，紧密连接与顶端膜的相互作用被认为对连接带的定位和信号传导很重要。根据已知的区室身份对时间分辨的邻近蛋白质组学数据进行了分组，并分析了它们的募集动力学（图 1c-e），结果表明，ZO-1 凝聚始于一组核心紧密连接蛋白。随后，ZO-1 凝聚物在它们围绕细胞周边延伸时接触顶端成分，表明这些形态和分子过程之间存在功能联系。

图1 紧密连接形成过程中 ZO-1 凝聚物的邻近蛋白质组学

为了直接观察和验证紧密连接组装过程中单个蛋白质的动力学，作者对蛋白质组学分析中确定的内源性标记蛋白质进行了定量实时成像，证实了极性蛋白 PATJ 在连接凝聚物延伸时到达连接处，这表明 ZO-1 凝聚物与顶端膜的相互作用可能对过渡到连续连接带很重要。随着凝聚物的延伸，PATJ 变得显著富集（图 2b）；此外，随着PATJ 浓度增加，圆形 ZO-1 凝聚物变形为偏心的细长形状（图 2c）。为了研究 PATJ 在 ZO-1 凝聚物延伸和紧密连接带形成中的作用，使用 CRISPR-Cas9 敲除了PATJ的 N 端 L27 结构域，汇合的 ∆L27-PATJ 单层细胞中 mN-ZO-1 分布的成像显示，与野生型 (WT) 组织相比，紧密连接带被破坏（图 2d）；细胞中的连接带长度和周长覆盖率整体大幅减少（图 2e）；跨上皮电阻显著降低（图 2f）。这些结果表明 ，在 ZO-1 凝聚物沿顶端界面延伸和形成功能性紧密连接屏障的过程中，PATJ 是必需的。

图2 PATJ 募集至连接凝聚体与延伸相关

为了更好地了解 PATJ 如何促进顶端周边连接凝聚物的生长，作者进行了双色受激发射损耗 (STED) 超分辨率显微镜成像，以确定紧密连接处 PATJ 和 ZO-1 的超微结构。STED 成像显示，完全形成连接的 ZO-1 在顶端细胞-细胞界面处形成了一条凝聚带（图 3a）。作者发现 PATJ 在 ZO-1 网络最顶端的链周围形成簇。对最顶端的 ZO-1 链和 PATJ 簇之间距离量化结果显示，ZO-1 带顶端最近邻距离分布的峰值为 40 nm，并且呈指数向侧膜衰减（图 3b、c）。因此，PATJ 与 ZO-1 非常接近，但在成熟组织中，它大多被排除在 ZO-1 凝聚物的核心之外。总之，超分辨率分析的结果表明 PATJ 在顶端膜和 ZO-1 网络之间形成界面，支持 PATJ 介导 ZO-1 凝聚物与顶端膜界面相互作用的想法。PATJ 和 ZO-1 之间的距离分析表明，PATJ 与 ZO-1 非常接近，但仍在局部被排除在凝聚物核心之外。这一观察结果表明 ZO-1 和 PATJ 之间复合物形成的潜在相互作用有两种：一种是介导共定位的吸引相互作用；另一种是驱动分离的排斥相互作用。根据之前的研究，作者推测，吸引相互作用可能由膜结合 PATJ 与 ZO 蛋白的短程结合促进；排斥可能是由于 PATJ 是顶端极性复合物的一部分，会阻止与侧膜混合。

图3 PATJ 定位于 ZO-1 带的顶端界面

对单个连接凝聚物延伸的量化数据（图 4a）表明，在 WT 细胞中，凝聚物延伸随着时间的推移而增加，40 分钟后每个细胞平均高达10-20 µm（图 4b）。通过测量每个凝聚体的强度总和 I 来量化每个凝聚体中 ZO-1 随时间变化的量，作者发现ZO-1 的量随时间呈线性增加，I(t) ∝ t，这表明在延伸过程中，更多的 ZO-1 分子被隔离到凝聚体中（图 4c）。ZO-1 与膜的结合亲和力ϵ取决于膜上的位置，在顶端-侧面界面处最高（图 4d，底部面板）。在顶端和侧面区域，ZO-1 结合亲和力较低，ϵ = ϵ₀；在这种情况下，稀相具有最低的自由能。在顶端-侧面界面处，ZO-1 结合亲和力较高，ϵ = ϵ_int，凝聚相具有最低的自由能。最初，该模型显示 ZO-1 在膜上的稀释结合，沿顶端界面略有富集（图 4f）。为了克服表面凝聚物形成的自由能垒，需要发生成核事件。这些初始成核位点被定义为顶端界面处具有更高结合亲和力的小圆形区域，ϵ = ϵ_nuc + ϵ₀，这使得表面凝聚物能够克服双阱自由能中的能垒（图 4e）。成核后，由于 ZO-1 在本体（细胞质）μ_bulk 和凝聚体边缘 μ 的化学势不平衡，凝聚体通过将 ZO-1 分子从本体募集到其边缘，沿顶端界面延伸（图 4f）。成核后，当结合亲和力 ϵ_int 高于阈值时，凝聚物以恒定速度沿顶端界面延伸（图 4g）。在这种情况下，凝聚物的延伸和质量随时间线性增长（图 4h）。综合起来，这些结果表明，顶端界面的预润湿转变与实验观察到的初始成核 ZO-1 凝聚体的延伸动力学一致。ZO-1的延伸速度对其与顶端界面的结合强度具有依赖性，这表明PATJ 作为 ZO-1 顶端连接器的作用与其介导凝聚体沿顶端界面生长的能力之间存在机制联系。

图4 预润湿转变的热力学解释观察到的延伸动力学

最后，作者量化了 PATJ 与 ZO-1 凝聚物的蛋白质-蛋白质相互作用（图 5a-c）：研究了 ∆L27-PATJ 组织中 PATJ 截断对连接带形成的挽救作用和渗透性（图 5a）；通过在 HEK293 细胞中共表达两种蛋白质，使用细胞分配分析量化了 ZO-1 凝聚物与 PATJ 截断的相互作用，并确定 PATJ 在 ZO-1 凝聚物中的分配系数（图 5b、c）。作者发现全长 PATJ 分配到 ZO-1 凝聚物中，表明存在有吸引力的相互作用，且 PATJ 的分配在很大程度上取决于 PDZ1 和 PDZ6 结构域的存在。为了量化 PATJ 截断挽救紧密连接形成的能力，作者通过测量10k 荧光葡聚糖在PATJ 截断挽救的 ∆L27-PATJ 组织中的跨上皮通透性（图 5f、g）确定了每个细胞的平均 ZO-1 带长度（图 5d、e）和紧密连接带的屏障功能。如图所示，与 WT 组织相比，∆L27-PATJ 组织中的 ZO-1 带长度和通透性屏障都受到严重损害。恢复实验的结果支持 ZO-1 通过 PATJ 与顶端膜相互作用的假设。嵌合 ZO-1–PATJ 构建体表明，PATJ 和 ZO-1 之间的直接相互作用足以使 ZO-1 凝聚物沿顶端界面延伸。

总之，本文的观察结果表明了 ZO-1 凝聚体的预润湿会反馈到顶端界面处的活性过程，说明细胞利用上皮细胞膜的极化组织通过预润湿转变来定位和塑造连接凝聚物。连接凝聚体的集体特性如何为发育过程中的细胞形状变化提供结构灵活性和稳健性，将成为未来研究的一个令人兴奋的途径。更一般地说，本文的工作对于细胞如何利用蛋白质凝聚体的普适物理特性来主动塑造高阶结构具有重要意义，此研究结果还为如何在生物医学应用中操纵紧密连接通透性，提供了一个新的视角。

原文链接 

https://www.nature.com/articles/s41586-024-07726-0

参考文献

参考文献

ⁱZihni, C., Mills, C., Matter, K. & Balda, M. S. Tight junctions: from simple barriers to multifunctional molecular gates. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17, 564–580 (2016).

ⁱⁱZhao, X., Bartolucci, G., Honigmann, A., Jülicher, F. & Weber, C. A. Thermodynamics of wetting, prewetting and surface phase transitions with surface binding. New J. Phys. 23, 123003 (2021).

供稿 | 刘雨嫣

审稿人 | 吴其乐

责编 | 囡囡

设计 / 排版 | 可洲 

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